DNA甲基化是表观遗传调控的一种重要机制，它通过在DNA的胞嘧啶碱基（C）上添加甲基基团（形成5-甲基胞嘧啶，5mC）来影响基因表达。这种甲基化状态可以通过细胞分裂传播，是细胞记忆转录状态的关键机制。尽管对DNA甲基化的酶促机制已有深入了解，但关于内源性信号分子如何调节DNA甲基化机制的研究仍然较少。
一氧化氮（NO）是一种内源性产生的自由基信号分子，参与多种生理过程，包括神经传递、免疫反应和血管稳态。然而，NO在疾病状态下的失调，特别是在癌症中，与多种病理状态相关。研究表明，NO合成酶（NOS2）的表达与多种癌症类型的不良预后、高死亡率和对化疗的抵抗性相关。尽管已知NO信号在癌症中发挥重要作用，但NO如何直接调节DNA甲基化机制仍不清楚。
为了探究NO作为DNA甲基化内源性调控因子的可能性，”Nitric oxide inhibits ten-eleven translocation DNA demethylases to regulate 5mC and 5hmC across the genome”采用了多种实验方法，包括体外酶活性测定、电子顺磁共振（EPR）光谱、密度泛函理论（DFT）计算、细胞培养实验、小鼠异种移植模型以及基因组范围的甲基化分析。
研究方法
1. 体外酶活性测定：研究团队使用纯化的TET2催化域与所有辅因子（2-OG、Fe(II)、抗坏血酸）、底物（合成5mC-DNA寡核苷酸）以及NO供体（如Sper/NO）进行孵育，通过MALDI-TOF-MS检测5mC和5hmC的相对含量，以评估NO对TET2酶活性的影响。
2. EPR光谱：为了验证NO与TET2酶中非血红素铁原子的结合，研究团队进行了EPR光谱分析，观察了NO处理后的TET2酶的特征信号变化。
3. DFT计算：为了深入理解NO与TET2酶的结合机制，研究团队进行了DFT计算，模拟了NO与铁原子的结合过程及其稳定性。
4. 细胞培养实验：研究团队选择了四种人类癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-668、PC-3和U251），这些细胞系均表达NOS2并能够在体内合成NO。通过外源性NO供体（如DETA/NO）处理细胞，研究团队用Epigentek的5mC（货号P-1030）和5hmC（货号P-1032）检测试剂盒测定了细胞中全局5mC和5hmC的水平。
5. 小鼠异种移植模型：为了验证NO在体内对DNA甲基化的影响，研究团队建立了NOS2表达的MDA-MB-231细胞系来源的小鼠异种移植模型，并通过氨基胍（AG）抑制NO合成，比较了NO产生与否的肿瘤中5mC的水平。
6. 基因组范围的甲基化分析：研究团队通过氧化还原降低代表性亚硫酸氢盐测序（oxRRBS）技术，对长期（10天）NO处理的TNBC细胞系进行了基因组范围的5mC和5hmC分析，以确定NO对特定基因调控区域甲基化状态的影响。
研究结果
1. NO抑制TET和ALKBH2酶活性：研究发现，生理浓度的NO能够可逆地抑制TET和ALKBH2酶的活性。通过MALDI-TOF-MS检测，研究团队发现NO以浓度依赖的方式抑制了TET2酶对5mC的氧化，形成了5hmC。EPR光谱和DFT计算进一步证实了NO与非血红素铁原子的结合，形成了二亚硝基铁复合体（DNIC）。
2. NO增加癌细胞和肿瘤中的5mC水平：细胞培养实验显示，外源性NO供体处理或内源性NO合成的癌细胞中，全局5mC和5hmC水平显著增加。小鼠异种移植模型的结果也支持了这一发现，NO产生的肿瘤中5mC水平显著高于NO合成被抑制的肿瘤。
3. NO调控特定基因调控区域的甲基化状态：通过oxRRBS分析，研究团队发现NO处理导致特定基因调控区域（如启动子、基因体和增强子）的5mC和5hmC水平增加。这些变化与NO调控的肿瘤相关基因的表达改变相关。
4. NO介导的转录组变化与患者预后相关：RNA测序分析显示，NO处理导致TNBC细胞系中数百个基因的转录水平显著上调或下调。值得注意的是，这些NO调控的基因在NOS2表达的乳腺癌患者肿瘤中也表现出类似的表达变化，并且与患者预后不良相关。
本研究中，Epigentek品牌的P-1030和P-1032试剂盒被用于全局5mC和5hmC水平的定量分析。这些试剂盒基于酶联免疫吸附测定（ELISA）原理，具有高灵敏度和特异性，能够准确测量DNA样本中5mC和5hmC的百分比含量。
P-1030试剂盒：用于检测DNA样本中的全局5mC水平。通过特异性抗体识别并结合5mC，该试剂盒能够提供DNA甲基化状态的直接量化指标，有助于研究DNA甲基化在基因表达调控、细胞分化、疾病发生发展等过程中的作用。
P-1032试剂盒：专门用于检测DNA样本中的5hmC水平。5hmC作为TET酶催化5mC氧化的中间产物，在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。P-1032试剂盒能够精确测量5hmC的含量，为研究TET酶活性、DNA去甲基化机制以及相关疾病提供重要信息。
