ELISA 实验在实际操作过程中可能会遇到各类问题，影响实验结果的准确性。以下将对常见问题、可能原因及对应的解决方法进行详细阐述。
标准曲线不佳
可能原因
- 倍比稀释标准品时未混匀。
- 过早稀释标准品。
- 加入的标准品体积不正确。
解决方法
- 稀释标准品的每一步都要充分混匀。
- 标准品在快要使用时再进行稀释。
- 使用校准过的移液器，快速且等量地将标准品分配到各个微孔中。
高背景或阴性对照值偏高
可能原因
- 阴性对照孔被阳性对照或样品污染。
- 抗体非特异性结合，封闭液不适合。
- 酶结合物过浓。
- 孵育温度过高。
- 底物在使用前曝光。
- 读板前停留时间过长。
解决方法
- 洗涤时，注意勿将洗液溢出孔外。
- 更换合适的封闭液。
- 检查酶结合物是否按说明书规定稀释。
- 检查孵育箱的温度是否正确、稳定。
- 底物应保存在暗处，避免曝光。
- 加终止液后 3 分钟内完成读板。
阳性对照值偏低或低吸光度
可能原因
- 试剂未平衡至室温。
- 检测体积偏小。
- 孵育时间过短。
- 底物受污染。
- 包装袋中有湿气。
- 样本中有抑制剂。
解决方法
- 实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温。
- 检查移液器吸液管道是否堵塞。
- 使用计时器，准确控制孵育时间。
- 使用新配置的试剂，重新进行实验。
- 检查袋中是否有干燥剂。
- 避免样本中含有抑制 HRP 酶活性的物质，如叠氮钠。
边缘效应
可能原因
- 蒸发。
- 温度不均匀。
解决方法
- 各步之间，须使用封版胶密封反应板。
- 校准孵育箱，避免叠放反应板。
标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因
- 样本中无检测物或检测物含量极低。
- 样本中其他物质影响/掩盖检测。
- 样本中检测物浓度过高，产生 Hook 效应导致假低值。
解决方法
- 设置内参，重新进行实验。
- 对样本作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率。
- 适当倍数稀释样本，使检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内。
重复性较差
可能原因
- 微孔中有气泡。
- 试剂未混匀。
- 样本中有杂质或沉淀物。
- 微孔包被面被吸头划破。
- 使用用过的封板胶纸。
解决方法
- 用针尖挑破气泡。
- 确保充分混匀试剂。
- 使用前对样本进行离心。
- 加液时小心操作，避免划破微孔包被面。
- 每次须使用新的封板胶封住反应孔。
假阳性反应
可能原因
- 洗涤不充分。
- 洗板机管道堵塞。
- 加结合物时，洒在微孔边缘。
- 检测样本中含有红细胞。
- 微孔中液体挥发。
解决方法
- 使用前需检查洗板机是否正常工作。
- 经常维护洗板机，防止管道堵塞。
- 小心向微孔加入结合物，将其加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触。
- 对检测样本进行离心，去除红细胞。
- 用封板胶密封反应孔，置于湿盒内，防止液体挥发。
整块板产生阳性 OD 值或整个板显蓝色
可能原因
- 洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染。
- 结合物浓度过高。
- 血清中有血清因子。
- 底物容器不洁净。
- 底物孵育时，微孔板曝光。
解决方法
- 洗涤时，使缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外。
- 检查结合物是否按照说明书推荐比例稀释。
- 勿加热血清。
- 用酸清洗底物容器瓶，再用蒸馏水冲洗。
- 加底物时，立即将板置于暗处。
整块板 OD 值偏低
可能原因
- 显色时间不足。
- 孵育温度偏低。
- 未加终止液。
解决方法
- 适当延长显色时间。
- 控制孵育温度在 36 度，此为最适反应温度。
- 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应。
显色缓慢
可能原因
- 样本未置于室温。
- 酶结合物活性减弱。
- 酶活性受到抑制，如存在叠氮钠。
- 显色温度不适当。
解决方法
- 实验开始前，将样本平衡至室温。
- 检测酶结合物的稀释度。
- 避免使用不当的防腐剂，如叠氮钠。
- 按说明书操作控制显色温度。
