定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术

一、简介

利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突变的酵母菌基因。分离到温度不敏感菌落后，必须采取两个步骤来证明在这种转化到cdc101-1菌株中的质粒含有野生型cdc101基因。第一步，假如这种观察到的互补现象是由质粒引起的，而非cdc101-1回复突变造成，互补质粒的分离必定导致质粒所带的选择标志及互补表型同时消失。第二步，必须排除是否被克隆的基因编码了这种突变的表型抑制基因的情形，而非野生型基因编码。这些均可通过互补实验来实现，并且可证明一个整合到基因组中的克隆基因的破坏是否能够互补原有的突变。

二、操作方法

定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术

三、原理

四、材料与仪器

酵母菌株带选择标记的YRp或YCp质粒适当的限制性内切核酸酶相应选择标记突变的酵母菌质粒标记的选择培养基平板培养皿

五、步骤

1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。

2)在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以产生缺口，在缺口的两侧各留下40〜200bP的同源区域，将得到的质粒片段进行凝胶纯化。缺口或切口尽可能靠近突变

位点。

3)如果用于致突变，通过PCR制备所需的致突变片段。如果是用来拯救或定位染色体等位基因，进行步骤4。

4)将1μg带缺口的质粒DNA和PCR产生的片段共同转化入带适当标记的酵母菌中。如果是用缺口修复来拯救基因组等位基因，就单独转化带缺口的质粒。

5)将转化子接种在专用于质粒标记选择平板上，鉴别成功修复的结果。对于恢复或定位染色体等位基因，利用质粒分离技术鉴别选择标记不稳定的转化子。如果突变正好位于缺口区域内，突变将会被修复的质粒携带。当突变位于缺口的附近时，其结果取决于交叉发生在什么部位。突变距离缺口区域越远，含有突变的质粒就会越少。