材料与仪器
甜菜碱 PCR 反应缓冲液 TEN+BSA 酶和酶缓冲液 核酸及引物PCR 仪
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂灭菌水配制的下列试剂，储存在指定的温度条件下。(1) 5mol/L 甜菜碱（SigmaB-2629 或 SigmaB-2754)过滤灭菌，室溫保存。(2) 10XKLA PCR 反应缓冲液，pH9.2500 mmol/LTris 碱 (Sigma;Trizma 碱)169 mmol/L(NH)4SO425 mmol/LMgCl21%Tween20不 用调节，pH 约 9.2(大片段扩增最佳），对于一些质粒，如 col El,pH7.9 比较适宜（见第 29章); 用 2mol/L 的 HCl 10XKLA 到 pH7.9, 不要将 pH 计直接插入到缓冲液中，以免外界 DNA 污染，可以取一小滴检测。要避免 10X 缓冲液结冰，过滤灭菌后储存于 4°C(如果缓冲液变得浑浊，用前摇匀仍可使用)。对于 Kletaq LA,Mg2+浓度很重要。在全长 Taq 酶扩增体系中（10XTLA),MgCl2只有7.5 mmol/L。(3) TEN+BSA10 mmol/L Tris-HCl(pH7.9)10 mmol/L NaCl0.lmmol/L EDTA100ug/ml BSA-20°C保存。一般用 TEN+BSA 稀释模扳 DNA 至 10ng/ml(或低于），这样可以增加重复性，特别是冻存后。2. 酶和酶缓冲液Klentaq LA 为 50〜55U/ul(推荐的酶浓度，根据复制子的长度而不同；见 6.1 疑难解答②)。3. 核酸及引物(1)10/40dNTP 混合物每种 dNTP10 mmol/L40 mmol/LMgCl2每 种 dNTP 可以从 Pharmacia Biotech 购得干粉，溶解成 l0mmol/L, 储存于-80°C。一般以 500/ul 分装dNTP 混合液储存于一 80°C, 如果常用则储存于-20°C。用 dNTP 混合液比购买 dNTP(100 mmol/L) 更有利于获得高产 PCR 产物。作者没有用新购的 dUTPase 作比较，因此用 dUTP 可能有点问题。(2)10umol/L 引物将引物稀释到 l0pmol/L,50ul 反应体系中加入 1ul，-20°C 保存.4. 设备PCR 仪。二、方法1.冰上加入下列试剂。10XKLA,pH9.2，有些质粒用 pH7.9 60ul10/40dNTP 混合物，终浓度为每种 l00umol/L 6ul5mol/L 甜菜碱（终浓度 1.2mol/L), 部分质粒终浓度可达 2mol/L 156ulH20 345ulKlentaqLA(如果靶 DNA 小于 2kb，加 lul 即可） 3ul混匀2.取出 48ul, 加入 2ul 引物，作为对照。3.剩余的溶液中加入浓度为 l0ng/ul 基因组 DNA, 混匀。4.每管取 48ul。5.每管中加入上下游引物各 1ul, 也可以将上下游引物混在一起，加入 2ul。不要担心混合不均匀，因为 PCR 扩增过程中的对流足以将其混匀。6.编制 PCR 扩增程序时，每一个循环的加热时间约 5〜10s, 有的 PCR 仪可能说明 5〜50s，不同的 PCR 仪可能有所区别。每一个循环 92°C 50s , 63°C 10 min。按以下设置循环数。
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