材料与仪器
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂去除 RNA 酶的双蒸水10XRT-PCR 缓冲液（去除 RNA 酶的双蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)2. 酶和酶缓冲液MMLV 逆转录酶（100~200U/ul)SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion)3. 核酸和寡核苷酸dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)随机引物（5umol/L)总 RNA(达到 2.5ug)4. 实验器材薄壁的 PCR 管二、方法1. 在冰上加 2ul50umol/L 的随机引物到薄壁的 PCR 管中（一个反应一管)。2. 加入 2.5ug 的总 RNA。3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。4. 添加去除 RNA 酶的双蒸水（RNaSe-freeH20)，使体积达到 16ul。5.70°C 加热 10min, 变性二级结构，然后立即放在冰上。6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。9.42°C 温浴 1h。10.95°C 加热10min, 灭活逆转录酶。11. 继续扩增步骤或停止反应，-2°C 储存。
