材料与仪器
琼脂糖凝胶 蒸馏水 DNA 点样染料 甘油 蒸馏水 溴酚蓝 二甲苯腈 FF 溴化乙锭溶液 任意引物（H-AP) cDNA dNTP 混合液 未标记的锚定引物 载体特异性引物 PCR 缓冲液 Tris-HCl KCl MgCl2 明胶 TaqDNA 聚合酶电泳装置 离心管 热循环仪 薄壁 PCR 管 UV 透射仪 微波炉
步骤
一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭 (见第 9 步）蒸馏水DNA 点样染料30% 甘油70% 蒸馏水0.003% 溴酚蓝0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)蒸馏水重新扩增混合液（见第 7 步）2. 核酸和寡核苷酸任意引物（H-AP)(2 mmol/L)cDNA(切割的条带），来自方案 5dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)未标记的锚定引物（H-T11M)(2umol/L)载体特异性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]3. 酶和酶缓冲液10XPCR 缓冲液100 mmol/LTris-HCl,pH8.4500 mmol/LKCl15 mmol/LMgCl20.01% 明胶TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)4. 专用设备电泳装置1.5 ml 离心管Parafilm热循环仪0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)UV 透射仪微波炉5. 附加试剂PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括准备好插入的 PCR-TRAP 克隆载体、T4DNA 连接酶（200u/ul)、蒸馏水、10X 连接缓冲液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl2，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)6. 细胞GH-competent 细胞7. 特别项目含有抗生素的琼脂平板（参考克隆系统推荐的专用抗生素与方案）二、方法1. 将方案 5 中切下的条带，放到 1.5 ml 离心管中，加入 1ml 蒸馏水。2. 浸泡 30 min，时常涡旋混匀。3. 除去蒸馏水（不要丟掉条带），再加入 50ul 新鲜的蒸馏水。4. 将离心管盖紧（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，将 cDNA 从凝胶中洗提出来。5. 离心 lmin，浓缩并收集凝胶。6. 将上清液转移到一个新的 1.5 ml 离心管中，弃去装有凝胶的管子。7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列组分完成 cDNA 的重新扩增。蒸馏水 22.6ul10XPCR 缓冲液 4.0uldNTP 混合液（250umol/L) 1.0ulH-AP 引物（2umol/L) 4.0ulH-T11M(2umol/L) 4.0ulcDNA 模板 4.0ulTaq DNA 聚合酶 0.4ul8. 将重新扩增的反应液放在热循环仪上，以最初 PCR 条件（见方案 4 第 1 步）进行反应。9. 配制含有溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶。a. 在玻璃烧瓶中，称 1.5 mg 超纯的电泳级琼脂糖。b. 加 1XTAE 至 100 ml。c. 将琼脂糖放到微波炉中熔化。d. 冷却后，加入 3ul1:1 的溴化乙锭溶液。e. 混匀后，倒入凝胶装置中。f. 放好梳子，等胶凝固。g. 电泳缓冲液为 1XTAE 溶液（凝胶装置不同，用量也不同）。10. 在 0.5 ml 的离心管中，加入 30ul 的再扩增反应液和 5ul DNA 点样染料。将混合液全部加到 1.5% 琼脂糖凝胶上。11. 在 70V 电压下电泳大约 45 min。12. 用 UV 透射仪进行观察，以确认 cDNA 再扩增反应产物。13. 按照厂商给的方案，将差异表达的 cDNA 克隆到推荐的 PCR-TRAP 克隆载体或其他合适的载体中。14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的载体特异性引物进行测序。如果使用其他的克隆载体，请参考厂商的测序说明书。
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