材料与仪器
动物组织乙酸缓冲溶液 葡萄糖醛酸酶 蛋白酶 氢氧化钾溶液 三氯乙酸 甲基叔丁基醚-环己烷离心管 培养箱 超声水浴 硅烷化梨形瓶 色谱柱
步骤
1.样品提取取充分均质的组织样品10 g于100mL玻璃离心管中，加入20mL0.1mol/L乙酸缓冲溶液，20mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶，于均质器上均质1min，置于培养箱中60培养1min。冷却后加入15mL200g/L三氯乙酸（采用广范围试纸，调pH1.5），在超声水浴上超声10 min。将提取液于10/15℃，4000g离心15min，若仍然存在悬浮物，温度可降低至8℃。倾出上清液，用20%氢氧化钾溶液调整pH至5.8～6.2，若在中和过程中出现沉淀，应进行过滤或再次离心。用200g/L三氯乙酸淋洗电极，并入溶液中，并使总体积接近500mL。移取20mL上述溶液于ISOLUTEHM-N柱中，平衡20min。制备两份20mL溶液，每份加入30mL甲基叔丁基醚-环己烷（8+2），于100mL硅烷化梨形瓶中，减压250 mbar，50℃旋转蒸发至干。2.净化将ISOLUTE-Si汾置于SPE装置上，预先按顺序加4mL乙酸乙酯，4mL乙酸乙酯-甲苯（20+80），抽干。用2mL乙酸乙酯-甲苯（20+80）溶解残渣，超声振荡，转移入柱。然后以4mL乙酸乙酯-甲苯（20+80）淋洗，弃去淋洗液。用4mL乙酸乙酯-甲苯（65+35）洗脱并收集氯霉素组分。2.衍生化收集溶液于40℃在缓慢氮气流下吹干。用200uL乙酸乙酯转移入反应小瓶，加入20uL内标溶液m-CAP，再次于40℃在缓慢氮气流下吹干。加入50uLBSTFA-TMCS（99+1）溶液，用内衬聚四氟乙烯（PTFE）的螺旋盖盖紧，于60℃反应lh。冷却后，在氮气流下缓慢吹干。加入25uL异辛烷溶解残渣。供GC-MS测定。3.仪器条件色谱柱：5%苯基、95%甲基硅氧烷，30m×0.25mm×0.25um；柱温：程序升温，60℃（lmin），以40℃/min，升至l80℃，以8℃/min，升至280℃，以5℃/min，升至300℃；进样方式：脉冲，无分流；进样器温度:270℃；载气：氦气；接口温度：300℃；离子源温度：l85℃；NCI离子化模式；反应气：甲烷，压力为533Pa（4000mTorr）；碰撞气：氩气，压力为0.27Pa（2mTorr）；电子能量:200eV；碰撞电流:200mA；CAP：m/z466（70）、468（70）、376（30）、378（30）；内标：m/z47l（70）。
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